Studio: Azione anti-tumorale dei cannabinoidi sul carcinoma epatocellulare

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Azione anti-tumorale dei cannabinoidi sul carcinoma epatocellulare: ruolo di attivazione di AMPK-dipendente di autofagia

Traduzione di Stefano Auditore ;  Studio di: D Vara , M Salazar , N Olea-Herrero , M Guzmán , G Velasco , 2, 3 e io Díaz-Laviada 1, 3

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la terza causa di morte per cancro in tutto il mondo. Quando questi tumori sono in fase avanzata, sono disponibili poche opzioni terapeutiche. Pertanto, è essenziale per la ricerca di nuovi farmaci contro questa malattia. In questo studio, abbiamo studiato gli effetti dei cannabinoidi – una nuova famiglia di potenziali agenti antitumorali – sulla crescita di HCC. Abbiamo scoperto che Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC, il principale componente attivo della Cannabis sativa) e JWH-015 (un recettore cannabinoide 2 (CB 2 ) cannabinoide agonista del recettore-selettivi) hanno ridotto la redditività delle linee cellulari di HCC umano HepG2 (fegato linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano) e HuH-7 (cellule di carcinoma epatocellulare), un effetto che si basava sulla stimolazione della BC 2 recettore. Abbiamo anche trovato che Δ 9 -THC e JWH-015-indotta autofagia si basa su triboli omologo 3 (TRB3) upregulation, e la successiva inibizione della serina-treonina chinasi Akt / bersaglio della rapamicina nei mammiferi C1 asse e adenosina monofosfato chinasi attivata ( AMPK) stimolazione. Inibizione farmacologica e genetica di AMPK monte chinasi sostenuto che calmodulina chinasi attivata chinasi β è stato responsabile per l’attivazione di AMPK indotto dai cannabinoidi e autofagia. Nel vivo studio ha rivelato che il Δ 9 -THC e JWH-015 riduce la crescita di xenotrapianti HCC sottocutaneo, un effetto che non era evidente quando l’autofagia è stata geneticamente di farmacologicamente inibita in quei tumori. Inoltre, i cannabinoidi sono stati anche in grado di inibire la crescita del tumore e di ascite in un modello ortotopico di carcinoma epatocellulare xenotrapianto. I nostri risultati possono contribuire alla progettazione di nuove strategie terapeutiche per la gestione di HCC.

Parole chiave: cannabinoidi, CB 2 recettori, AMPK, l’autofagia, carcinoma epatocellulare

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è uno dei tumori solidi più comuni e la terza causa di morte per cancro in tutto il mondo. 1 La sua prognosi rimane riservata, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni di <5%. 2 E ‘la causa più comune di morte nei pazienti con cirrosi 3 e, secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità, l’incidenza di carcinoma epatocellulare è previsto un aumento fino al 2030. La sopravvivenza globale dei pazienti con HCC non è significativamente migliorata negli ultimi due decenni. I trattamenti attuali sono applicabili solo alle prime fasi di sviluppo del tumore e comprendono la resezione del tumore, il trapianto di fegato, chemioembolizzazione e amministrazione sorafenib. 4Tuttavia, circa la metà dei pazienti che soffrono di recidiva del tumore. Il più importante meccanismo di progressione del cancro del fegato è proliferazione cellulare. Sebbene negli ultimi anni diversi studi clinici hanno testato l’efficacia di agenti che agiscono selettivamente importanti vie di segnalazione coinvolte nel controllo di questo processo, nessun miglioramento rilevante nella prognostico / sopravvivenza dei pazienti con HCC è stato raggiunto finora, 5 e, quindi, è necessario identificare nuove strategie terapeutiche per la gestione di HCC.

I cannabinoidi sono mediatori lipidici originariamente isolato dalla pianta canapa Cannabis sativa che producono i loro effetti attivando principalmente due ricevitori G-protein-coupled recettore cannabinoide: 1 (CB 1 ), che è altamente abbondante nel cervello, e del recettore cannabinoide 2 (CB 2 ), che si esprime principalmente in tessuti non neuronali. Recentemente, numerosi studi hanno evidenziato il ruolo dei cannabinoidi come potenziali farmaci anti-tumorali a causa della loro capacità di ridurre tumorale in modelli animali differenti, tra cui glioma, 6 carcinoma mammario 7 , 8 e cancro alla prostata. 9 , 10 Recenti ricerche hanno inoltre riportato che il cannabinoide sintetico WIN-55 212-2 inibisce la crescita del carcinoma epatico. 11 , 12

E ‘stato descritto che il Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC), il principale componente attivo della marijuana, provoca la morte delle cellule del glioma umano attraverso la stimolazione di una via ER stress che attiva l’autofagia e promuove l’apoptosi. 13 , 14 L’autofagia è un auto cellulare processo digestivo in cui i componenti citoplasmatici sfusi e organelli intracellulari sono sequestrati in due vescicole di membrana chiamato autophagosomes e consegnato per la degradazione ai lisosomi. 8 , 15 ,16 Nel fegato, l’autofagia potrebbe avere un ruolo importante nella regolazione del bilancio energetico di base funzioni cellulari. 17 Sebbene atti autofagia funzionali come un buffer stress metabolico, molte linee di evidenza supportano un ruolo per autofagia nella sopravvivenza cellulare antagonizzare e nel promuovere la morte cellulare e apoptosi. 18 , 19 , 20 Autofagia ha un ruolo importante nel cancro e inibizione di questo processo cellulare è stato proposto di contribuire alla progressione HCC, 21 , 22 e, quindi, è un bersaglio potenzialmente molto importante per la prevenzione e il trattamento del cancro al fegato.

Questo studio è stato quindi intrapreso per valutare la potenziale attività antitumorale dei cannabinoidi nel HCC ed i meccanismi responsabili per l’azione dei cannabinoidi in quella malattia devastante.Abbiamo scoperto che, sia in colture cellulari e nei topi xenotrapiantati, Δ 9 -THC e il CB sintetico 2agonista selettivo del recettore JWH-015 promuovere la morte HCC umano attraverso la stimolazione autofagia. Forniamo anche un meccanismo molecolare alla base CB 2 recettore-mediata segnalazione anti-tumorali. Queste osservazioni possono aprire la strada alla progettazione di nuove strategie terapeutiche per il trattamento del carcinoma epatocellulare.

 

Risultati

Δ 9 -THC e JWH-015-indotta autofagia e apoptosi si basa su CB 2 recettori

Per studiare l’attività dei cannabinoidi su cellule di HCC, in primo luogo abbiamo analizzato l’effetto di Δ9 -THC (un CB 1 / CB 2 agonista del recettore-mista che costituisce il principale ingrediente psicoattivo della Cannabis sativa ) e JWH-015 (un CB 2 recettori agonista selettivo) sulla HepG2 (fegato linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano) e HuH-7 (cellule di carcinoma epatocellulare), le cellule, due linee di HCC che esprimono CB 1 e CB 2 recettori dei cannabinoidi (supplementare Figura 1A). Il trattamento con Δ 9 -THC riduce la vitalità delle HepG2 e Huh-7 cellule, un evento che è stato impedito dalla co-incubazione con SR144528 (SR2, il CB 2 antagonista del recettore-selettivi), ma non con SR141716A (SR1, un CB 1 recettore antagonista selettivo) (complementare Figura 1B). Allo stesso modo, JWH-015 è diminuita la vitalità delle cellule di HCC, e co-incubazione con SR2 abrogate questo effetto (complementare Figura 1B). Queste osservazioni supportano che la stimolazione dei CB 2 recettori è responsabile per la diminuzione della vitalità cellulare innescato da cannabinoidi sulle cellule HCC.

Δ 9 -THC e JWH-015 inibiscono la crescita delle linee di epatocarcinoma umano HepG2 e HuH-7 attraverso la stimolazione autofagia

È stato recentemente dimostrato che i cannabinoidi inducono morte cellulare glioma umano attraverso la stimolazione autofagia in vitro e in vivo. 13 , 23 Abbiamo quindi esaminato se Δ 9 -THC e JWH-015 attiva un meccanismo simile in cellule HCC. Dopo stimolazione autofagia, il autofagia proteina LC3 (associata ai microtubuli proteina 1 catena leggera 3 α ) diventa coniugato fosfatidiletanolamina (PE), che si rivolge questa proteina alla membrana delle autophagosomes. La forma autofagosoma associata lipidated di LC3 (LC3-II) può essere monitorato mediante immunofluorescenza (cellule autofagiche esibiscono un modello caratteristico di LC3 puncta) o Western Blot (LC3-II dispone di mobilità elettroforetica superiore non lipidated LC3). Immunofluorescenza ha rivelato che LC3 mostrato una distribuzione punteggiato, coerente con la sua traslocazione al autofagosoma, in celle che erano stati trattati con Δ 9 -THC e JWH-015 ( Figura 1a ). Allo stesso modo, l’incubazione di HepG2 e Huh-7 cellule con Δ 9 -THC e JWH-015 ha aumentato i livelli di forma lipidated di LC3 ( Figura 1b ). Inoltre, l’inibizione farmacologica con E64d e pepstatina A (PA) di proteasi lisosomiali (gli enzimi responsabili della degradazione del contenuto autophagosome dopo fusione con il lisosoma) migliorato l’accumulo di LC3-II (così come del carico autophagosome p62) in cellule che erano stati trattati con THC o JWH-015, sostenendo così il fatto che il trattamento dei cannabinoidi porta a autofagia dinamica in cellule HCC ( Figura 1b ).

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Figura 1

Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) e JWH-015 il trattamento induce l’autofagia nel carcinoma epatocellulare (HCC) cellule. ( a ) HepG2 e Huh-7 cellule sono state trattate con Δ 9 -THC o JWH-015 per 24 ore e la proteina associata ai microtubuli 

Poi, abbiamo studiato se l’autofagia è stato direttamente coinvolto nel meccanismo di morte cellulare indotto dai cannabinoidi. Come mostrato in Figura 1c , morte cellulare è stata inibita quando autofagia stato farmacologicamente bloccato in una fase molto precoce (mediante incubazione con 3-metiladenina (3-MA), un inibitore di Vps34, una classe III fosfatidil inositolo-3-chinasi che ha un ruolo cruciale nella autofagia iniziazione 24 ) o in una fase finale (mediante incubazione con E64d e PA). Allo stesso modo, abbattere di Atg5 (un gene autofagia essenziale che fa parte di uno dei due sistemi di coniugazione di proteine ​​necessarie per l’allungamento autofagosoma 25 , 26 ) alterata morte cellulare THC-o JWH-015-indotta ( Figura 1d ). Nel loro insieme, queste osservazioni supportano fortemente che l’autofagia è necessario per la morte delle cellule HCC indotto dai cannabinoidi.

Molte linee di evidenza indicano che vi è un cross-talk tra autofagia e apoptosi. 27 Per valutare se l’autofagia indotto dai cannabinoidi è stato coinvolto nella induzione di apoptosi, HepG2 e Huh-7 cellule sono state incubate sia con Δ 9 -THC e JWH-015 in la presenza della 3-MA, e livelli di procaspase-3 sono stati rilevati mediante immunoblot. Come mostrato in Figura 1e , pre-incubazione con 3-MA impedito il clivaggio di procaspase-3, suggerendo che l’induzione di autofagia cannabinoidi era precedente e necessario per apoptosi.

AMPK attivazione e TRB3 up-regolazione sono coinvolti in Δ 9 -THC e autofagia JWH-015-indotto e l’apoptosi delle cellule di HCC

I meccanismi di stimolazione dell’autofagia di cannabinoidi nel glioma e altri tipi di cellule tumorali si basa sulla stimolazione di un percorso da stress ER, che porta alla upregulation del pseudokinase tribbles omologo 3 (TRB3). Quest’ultimo proteina interagisce con serina-treonina chinasi Akt (Akt) e promuove l’inibizione del target della rapamicina nei mammiferi C1 (mTORC1) complessa, che porta alla stimolazione autofagia. 23 Come mostrato in Figura 2 , THC e JWH-015 aumentato la fosforilazione della α -subunità della traduzione eucariotica fattore di inizio 2 (eIF2 α , un marchio di garanzia della risposta allo stress di ER; Figura 2a ), aumento Trb3 livelli ( Figura 2b ) e diminuito la fosforilazione di Akt, p70S6 chinasi (un substrato ben consolidata di mTORC1) e la proteina ribosomale S6 (con un obiettivo p70S6 chinasi) in HepG2 e Huh-7 cellule ( figura 2c ). Inoltre, l’abbattimento selettivo di TRB3 abrogato inibizione indotto dai cannabinoidi di Akt / mTOR, autofagia e morte cellulare (supplementare Figura 2), sostenendo in tal modo il fatto che il meccanismo con cui i cannabinoidi promuove la morte delle cellule del glioma anche opera in cellule di HCC.

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Figura 2

Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) e JWH-015 upregulate triboli omologo 3 (TRB3), inibiscono la serina-treonina chinasi Akt / bersaglio della rapamicina nei mammiferi C1 (Akt/mTORC1) percorso e attivare adenosina monofosfato chinasi attivata dal .. .

Da notare, abbiamo osservato che il trattamento di HepG2 e HuH-7 cellule con THC o JWH-015 aumentato la fosforilazione della proteina chinasi dell’adenosina monofosfato-attivata (AMPK), un importante sensore della concentrazione di nutrienti intracellulari che è stato proposto di avere un ruolo critico nella la regolazione dell’autofagia come indotta da ipossia o privazione di nutrienti ( Figura 2b ).Inoltre, blocco farmacologico dei CB 2 recettori con SR2 abrogato l’effetto di Δ 9 -THC e JWH-015 on Akt, S6 e AMPK fosforilazione, nonché autofagia ( figura 2d e complementare Figura 1C). Abbiamo quindi chiesto se AMPK può anche avere un ruolo nella regolazione dell’effetto antiproliferativo evocato da cannabinoidi in cellule di HCC. In linea con questo concetto, quando AMPK è stata bloccata farmacologicamente con dorsomorphin ( Figura 3a ) o geneticamente inibito con piccoli RNA interferenti (siRNA) ( Figura 3b ), HepG2 e Huh-7 cellule erano più resistenti alla morte cellulare indotto dai cannabinoidi. Allo stesso modo, AMPK atterramento impedito LC3 lipidazione ( Figura 3c e integrative Figura 2C). Queste osservazioni supportano il fatto che l’attivazione di AMPK è necessaria per la stimolazione della morte cellulare mediata da autofagia cannabinoidi in cellule HCC.

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Figura 3

Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) e JWH-015 inducono autofagia via adenosina monofosfato-activated kinase (AMPK). ( a ) HepG2 e Huh-7 cellule sono state incubate con Δ 9 -THC o JWH-015 per 48 ore in presenza di 0,5  

AMPK e TRB3 regolano l’autofagia indotto dai cannabinoidi su cellule di carcinoma epatico attraverso meccanismi diversi

AMPK ha dimostrato di inibire mTORC1. 28 A differenza di Akt, AMPK attiva sclerosi tuberosa complessa 2 (TSC2), una proteina GTPasi-attivando responsabile per il blocco dei mTORC1. 28 Pertanto, accanto studiato se questo fosse il meccanismo con cui AMPK stimolato autofagia nel nostro sistema.Come mostrato in figura 3c e complementare Figura 2C, AMPK silenziamento abrogato l’effetto di Δ 9 -THC e JWH-015 nella fosforilazione di AMPK e suoi bersaglio acetil-CoA carbossilasi (ACC) a valle, nonché su autofagia, ma non ha modificare l’effetto del trattamento cannabinoidi sulla fosforilazione di Akt, TSC2 (dati non mostrati) o le mTORC1 legati substrati 4EBP1 e S6. Al contrario, TRB3 atterramento non ha influenzato AMPK o fosforilazione ACC, ma ha inibito il calo indotto dai cannabinoidi in Akt, TSC2, 4EBP1 e S6 fosforilazione e LC3 lipidazione. Analogamente, blocco farmacologico di biosintesi ceramide utilizzando ISP-1 (un inibitore di serina palmitoyltransferase farmacologico, uno degli eventi a monte che innescano TRB3 upregulation in risposta al trattamento cannabinoide 29 ) abrogato l’effetto di Δ 9 -THC sulla Akt, TSC2, 4EBP1 e S6 fosforilazione, nonché LC3 lipidazione, ma non ha influenzato AMPK fosforilazione. Queste osservazioni supportano che la stimolazione cannabinoide-evocata dell’autofagia sulle cellule HCC si basa su due diversi meccanismi: (i) inibizione dell’asse Akt/mTORC1 via TRB3 upregulation e (ii) stimolo AMPK. (Uno schema è mostrato in Figura 5 .)

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Figura 5

Schema del meccanismo proposto di cannabinoidi indotta carcinoma epatocellulare (HCC), la morte delle cellule. Trattamento cannabinoidi stimola l’autofagia attraverso due meccanismi differenti: (i) la up-regolazione di triboli omologo 3 (TRB3) e inibendo di conseguenza la 

L’attivazione di AMPK da cannabinoidi si basa su CAMKK

Abbiamo poi studiato il meccanismo con cui i cannabinoidi attivano AMPK. Tra le diverse chinasi proposti di agire come AMPKKs, l’umana oncosoppressore fegato chinasi B1 (LKB1) e la chinasi calmodulina chinasi attivata (CaMKK) sono ora ampiamente accettata come quelli più rilevanti. 30Inibizione di LKB1 espressione con siRNA non ha avuto alcun effetto significativo sulla redditività di HepG2 (cannabinoidi trattati Figura 4a ) o Huh7 (supplementare Figura 3) cellule. Allo stesso modo, l’effetto del trattamento con cannabinoidi sui AMPK attivazione, Akt/mTORC1 via di inibizione e di autofagia (LC3 lipidazione) non è stata influenzata da LKB1 silenziamento ( figura 4a ), sostenendo il fatto che LKB1 non è coinvolta nella attivazione di AMPK indotto dai cannabinoidi e autofagia in cellule di HCC. Al contrario, knockdown selettiva di CaMKK β o l’incubazione con le CaMKK farmacologiche STO609 inibitore impedito la diminuzione cannabinoidi evocato in vitalità cellulare HCC ( figure 4 c e supplementari Figura 3), aumento della fosforilazione di AMPK e ACC ( figure 4 c ) e autofagia ( figure 4 c ), indicando che l’attivazione di AMPK da cannabinoidi in cellule di HCC si basa su CaMKK β .Di nota, blocco genetica o farmacologica di CaMKK β non modifica l’inibizione del pathway Akt/mTORC1 evocato da questi agenti, che supporta volta il fatto che mTORC1 inibizione da cannabinoidi in HCC avviene indipendentemente attivazione di AMPK ( Figure 4b e c ).

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Figura 4

Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) e JWH-015 attivano adenosina monofosfato-attivato chinasi AMPK via CaMKK β . ( a ) del pannello sinistro: Effetto di Δ 9 -THC (8 μ M) o JWH-015 (8 μM) sulla vitalità  

L’autofagia è necessario per Δ 9 -THC e JWH-015 azione anti-tumorale in xenotrapianti HCC umani

Per studiare la capacità di Δ 9 -THC e JWH-015 per inibire la crescita di HCC in vivo , in primo luogo abbiamo generato xenotrapianti tumorali da sottocutaneo inoculazione di HepG2 o HuH-7 cellule in topi nudi. I topi sono stati trattati quotidianamente con veicolo (controllo), 15 mg / kg Δ 9 -THC o 1,5 mg / kg JWH-015 per 15 giorni. Come mostrato in Figura 6a , la somministrazione di cannabinoidi quasi totalmente bloccato la crescita dei tumori delle cellule HepG2-derivati. Inoltre, il trattamento con il Δ 9 -THC e JWH-015 potenziato AMPK fosforilazione e la ridotta fosforilazione di Akt, che è stato accompagnato da una diminuzione della fosforilazione di S6 e un aumento di LC3-II lipidazione ( Figura 6b ). Allo stesso modo, procaspase-3 livelli sono stati anche diminuiti nei tumori trattati con cannabinoidi ( Figura 5b ). Risultati simili sono stati ottenuti con HuH-7 tumori derivati ​​dalle cellule, in cui Δ 9 -THC e JWH-015 amministrazione ha inoltre ridotto la crescita tumorale ( Figura 6c ), ha aumentato la fosforilazione di AMPK, diminuzione Akt e S6 fosforilazione e migliorata LC3 lipidazione e caspasi- 3 attivazione ( Figura 6d ).

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Figura 6

Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) e JWH-015 riduce la crescita di HepG2 e HuH-7 xenotrapianti di tumori derivati ​​dalle cellule.Atimici topi nudi sono stati iniettati per via sottocutanea (SC) nel fianco destro con cellule HepG2 ( a e ​​b ) o Huh-7 cellule ( c e 

Di esaminare ulteriormente il ruolo dell’autofagia sull’azione antitumorale dei cannabinoidi, è stata condotta un’altra serie di esperimenti per analizzare l’effetto dei cannabinoidi sulla crescita di HepG2 xenotrapianti di tumori in cui Atg5 espressione era stato abbattuto in vivo . Come mostrato in figura 7a , Δ 9 -THC e JWH-015 non è riuscito a inibire la crescita di tumori Atg5-silenziati, ma non di quei tumori che erano state trasfettate con siRNA di controllo. Inoltre, l’inibizione farmacologica di autofagia utilizzando 3-MA ha impedito la diminuzione della crescita del tumore evocata da Δ 9 -THC e JWH-015 ( figura 7b ). Presi insieme, questi risultati supportano fortemente il fatto che l’autofagia è necessario per l’azione antitumorale dei cannabinoidi nel carcinoma epatocellulare.

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Figura 7

L’autofagia è necessario per l’azione anti-tumorale di Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) e JWH-015 sul carcinoma epatocellulare (HCC) xenotrapianti tumorali. ( a ) topi nudi atimici sono stati iniettati per via sottocutanea (sc) nel fianco destro con HepG2 

Infine, abbiamo testato l’efficacia anti-tumorale di cannabinoidi in un modello di carcinoma epatico ortotopico. Cellule HepG2 sono state inoculate nel fegato di topi nudi, e dopo 1 settimana, topi sono stati trattati per via intraperitoneale con veicolo (controllo), 15 mg / kg Δ 9 -THC o 1,5 mg / kg JWH-015 per 10 giorni. Come mostrato in figura 8a , trattamento cannabinoidi quasi completamente impedito epatomegalia e ascite. Inoltre, i livelli del marker tumorale HCC α -fetoproteina (AFP) sono stati drasticamente ridotti nel fegato di animali trattati con Δ 9 -THC e JWH-015 ( figura 8b ). Analisi dei campioni di tumore hanno rivelato che cannabinoide trattamento potenziato AMPK fosforilazione di Akt e inibito e S6 fosforilazione. Inoltre, il THC e JWH-015 potenziato l’autofagia e apoptosi in questi tumori ( Figura 8a ).

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Figura 8

Effetto anti-tumorale di Δ 9 -tetraidrocannabinolo (Δ 9 -THC) e JWH in un modello ortotopico tumore trapianto di carcinoma epatocellulare (HCC). Il modello ortotopico trapianto di HCC è stato istituito con intraepatica impianto di HepG2 

Nel loro insieme, queste osservazioni robustamente supportano il fatto che cannabinoide azione anti-tumorale in HCC si basa su AMPK stimolazione, Akt inibizione e attivazione dell’autofagia in cellule HCC sia in vitro e in vivo .

Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato che il cannabinoide naturale Δ 9 -THC e il CB 2 agonista del recettore-selettivi JWH-015 inibiscono la crescita delle cellule di carcinoma epatico attraverso la stimolazione della autofagia. È importante sottolineare che, anche se le linee cellulari di HCC umani utilizzati (HepG2 e HuH-7) espressi sia CB 1 e CB 2 recettori, solo CB 2 attivazione è stato coinvolto nella effetto pro-autophagic e antiproliferativa indotta da cannabinoidi su queste cellule. Ciò è in linea con la recente osservazione che il cannabinoide sintetico WIN-55, 212-2 apoptosi indotta in cellule HepG2 in un processo che è stato parzialmente inibito dalla CB 2 antagonista selettivo del recettore AM630. 11 Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che i CB 2 recettori sono sovraespresse in HCC e correlano con buona prognosi. 31 Tali considerazioni, insieme con la nostra, sostenere il fatto che la stimolazione dei CB 2 recettori potrebbe essere una nuova strategia terapeutica per promuovere la morte HCC.

Il nostro studio dimostra che il meccanismo di cannabinoidi azione anti-tumorale in HCC si basa sulla stimolazione della autofagia e la successiva attivazione di apoptosi. A seconda dell’impostazione fisiopatologico, l’autofagia è stata proposta per la protezione da apoptosi, agiscono come una via apoptosi-alternativa per indurre la morte delle cellule o di agire insieme con l’apoptosi come un meccanismo combinato di morte cellulare. 32 Tuttavia, ben poco si sa circa il ruolo che l’interscambio tra questi due processi cellulari hanno nel controllo della crescita tumorale in risposta ad agenti antitumorali. Le nostre osservazioni sono in linea con precedenti risultati ottenuti in cellule di glioma umano 13 e sostenere il fatto che la stimolazione di autofagia in risposta al trattamento cannabinoidi porta ad apoptosi. Tuttavia, ulteriori ricerche sono ancora necessarie per chiarire i meccanismi precisi che collegano entrambi i processi cellulari in seguito al trattamento dei cannabinoidi.

Stimolazione dell’autofagia in molti contesti cellulari si basa sulla inibizione del complesso mTORC1, che hanno un ruolo centrale nel controllo della sintesi proteica, crescita cellulare e la proliferazione cellulare attraverso la regolazione di numerose obiettivi a valle. Come risultato della sua posizione centrale nel controllo della omeostasi cellulare, mTORC1 integra segnali da ingressi diversi. Uno dei più importanti regolatori a monte della mTORC1 è il pro-sopravvivenza chinasi Akt, che fosforila e inattiva TSC2 (un inibitore della mTORC1 attivatore Rheb) e PRAS-40. Pertanto, l’attivazione di Akt stimola mTORC1 e inibisce l’autofagia. In questo lavoro, abbiamo trovato che il trattamento con cannabinoidi su cellule di carcinoma epatico porta ad Akt e mTORC1 inibizione, che è in accordo con i nostri recenti studi in cellule di glioma. 13 Così, era stato precedentemente dimostrato che l’inibizione del pathway Akt/mTORC1 da cannabinoidi si basa su la stimolazione di un percorso da stress ER, che porta alla upregulation del pseudokinase TRB3, l’inibizione dell’asse Akt/mTORC1 e induzione di autofagia. 13 , 23In questo studio, Δ 9 -THC e JWH-015 promosso ER stress e maggiore espressione TRB3. Inoltre, Akt/mTORC1 inibizione e autofagia sono stati aboliti quando biosintesi di ceramide è stata inibita o quando TRB3 espressione ammutolisce, suggerendo che questo potrebbe essere un meccanismo generale di cannabinoidi azione anti-tumorale. Di importanza, abbiamo anche scoperto che Δ 9 -THC e JWH-015 attivare AMPK in cellule di HCC e che l’inibizione farmacologica o genetica di questa chinasi ha un effetto inibitorio simile morte cellulare indotto dai cannabinoidi e autofagia. AMPK ha dimostrato di regolare negativamente mTORC1 via TSC2 attivazione, che porta anche alla stimolazione autofagia, 33e quindi abbiamo chiesto se i cannabinoidi inibiscono anche mTORC1 attraverso questo meccanismo nelle cellule di HCC. In disaccordo con questa possibilità, i nostri dati mostrano che – a differenza di TRB3 silenziamento – AMPK atterramento non impedisce l’inibizione mTORC1 indotto dai cannabinoidi. Inoltre, abbattere di TRB3 non influenza la stimolazione di AMPK da cannabinoidi.Queste osservazioni suggeriscono che TRB3 e AMPK (i) sono attivati ​​da meccanismi differenti in risposta al trattamento cannabinoidi, e (ii) regolano autofagia agendo in diverse fasi.

Due percorsi convergenti sono stati descritti per la regolazione AMPK: uno diretto da LKB1, dipende da un cambiamento nella AMP cellulare, e un altro diretto da CaMKKs, dipende da cambiamenti nel intracellulare di Ca 2 + . 34 La drastica riduzione della fosfo-AMPK e fosfo- ACC ottenuta su silenziamento del CaMKK β indica che quest’ultimo chinasi anziché LKB1 è l’enzima AMPKK dominante in cellule HCC in risposta ai cannabinoidi. Pertanto, i cannabinoidi inducono l’autofagia nelle cellule di HCC, possibilmente da un meccanismo a due punte, una polo (simile a quello che opera in cellule di glioma) coinvolgendo ER stress, TRB3 e Akt/mTORC1 inibizione, ed un altro affidamento sulla stimolazione AMPK via CaMKK β . Un modello di questo meccanismo di azione dei cannabinoidi in cellule HCC è illustrato nella figura 5 .

Inoltre, è stato recentemente dimostrato che AMPK si lega e fosforila direttamente la Ser / Thr chinasi ULK1, l’ortologo mammiferi del lievito proteina chinasi Atg1, e che è richiesto per tale fosforilazione autofagia ULK1-mediata. 35 , 36 Così, sotto alcune impostazioni cellulari, mTORC1 inibizione e attivazione di AMPK possono cooperare per far scattare l’autofagia. 36 , 37 , 38 Anche se la ricerca futura è necessaria per chiarire completamente questo punto, i nostri dati suggeriscono che questo potrebbe essere il meccanismo attraverso il quale i cannabinoidi attivano l’autofagia nelle cellule di HCC.

Da notare, che è stato recentemente descritto che mTOR segnalazione ha un ruolo fondamentale nella patogenesi del carcinoma epatico e che gli inibitori di mTOR hanno attività antitumorale in modelli sperimentali di HCC. 39 , inoltre, è diminuito l’autofagia in HCC correla con un fenotipo più aggressivo delle cellule tumorali e poveri prognosi. 21 , 40 Qui abbiamo trovato che il trattamento con cannabinoidi riduce la crescita di due diversi modelli di xenotrapianti HCC sottocutaneo in concerto con diminuzione mTORC1 attivazione, una maggiore fosforilazione di AMPK e aumentato l’autofagia e apoptosi in quei tumori. Inoltre, abbattere del gene autofagica Atg5 come pure l’inibizione farmacologica di autofagia abolito drasticamente l’attività antitumorale dei cannabinoidi contro sottocutaneo HCC xenotrapianti.Inoltre, Δ 9 -THC e JWH-015 in modo efficiente ridotto ascite sviluppo e l’espressione AFP in un modello ortotopico di carcinoma epatico, che anche in parallelo mTORC1 inibizione, l’attivazione di AMPK e la stimolazione dell’autofagia in quei tumori. I nostri dati rappresentano la prima prova per l’azione antiproliferativa dei cannabinoidi in cellule HCC in vivo e di supporto che la capacità dei cannabinoidi di inibire mTORC1, stimolare e migliorare AMPK autofagia potrebbe essere terapeuticamente sfruttata per la gestione di HCC.

 

Materiali e Metodi

Reagenti

Δ 9 -THC è stato ottenuto da GW Pharm GmbH (Francoforte, Germania) e JWH-015 è stato acquistato da Sigma (St. Louis, MO, USA). Il CB 1 antagonista SR-141716 e il CB 2 antagonista SR-144528 sono state gentilmente concesse da Sanofi-Synthelabo (Parigi, Francia). L’anticorpo policlonale anti-LC3 è stato ottenuto da MBL International (Woburn, MA, USA) e l’anti-PS6, pAKT-ser473, PACC, ACC, peIF2α , pAMPK e anticorpi policlonali AMPK sono stati ottenuti da Cell Signaling Technology (Danvers, MA , USA). L’anticorpo anti-caspasi-3 e 3-MA sono stati acquistati da Sigma. Il inibitori E64d e PA sono state acquistate a Roche Diagnostics (Mannheim, Germania). Il CaMKK α / β STO609 inibitore è stato acquistato da Sigma. Atelocollagen (AteloGene) è stato acquistato da Cosmo Bio Co. (Tokyo, Giappone).Tutti gli altri prodotti chimici sono stati ottenuti da Sigma.

Colture cellulari

HCC umani HepG2 (ATCC, HB-8065) ​​(Rockville, MD, USA) sono stati coltivati ​​secondo i fornitori. La linea cellulare di epatoma umano HuH-7 è stato fornire gentilmente dal Dott. Lisardo Boscá (IKnstituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, Madrid, Spagna). Cellule erano ordinariamente crescita DMEM/10% FBS integrato con 1% di aminoacidi non essenziali e 100 IU / ml di penicillina G sodica, 100 μ g / ml di streptomicina solfato, 0,25 μ g / ml amfotericina B (Invitrogen, Paisley, UK) . Un giorno prima degli esperimenti, il mezzo è stato cambiato a 0,5% FBS medie. Esperimenti sono stati effettuati quando monostrati cellulari erano 80% confluenti.

Analisi di RT-PCR

L’RNA totale è stato isolato da cellule di reagente Trizol da Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo il protocollo del produttore. Un microgrammo di RNA totale è stato retrotrascritto a cDNA con la M-MLV Reverse trascrittasi kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Due microlitri di reazione di RT erano poi amplificati PCR con primers specifici per CB 1 : innesco senso, 5′-TATATTCTCTGGAAGGCTCACAGCC-3 ‘innesco antisenso, 5′-GAGCATA CTGCAGAATGCAAACACC-3’ (per l’amplificazione di un prodotto di 270 bp per CB umano 1 ) e CB 2 : senso di primer, 5′-TTTCCCACTGATCCCCAATG-3 ‘innesco antisenso, 5′-GAGCATACTGCAGAATGCAAACACC-3’ (per l’amplificazione di un prodotto di 333 bp per CB umano 2 ) . prodotti di PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi su etidio bromuro macchiato di agarosio al 2% gel e il DNA è stato rilevato da esposizione ai raggi UV.

Western Blot

Dopo diversi trattamenti secondo le celle esperimenti sono state lisate in tampone di lisi ghiacciato (50 mM Tris (pH 7,4), 0,8 M di NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 μ g / ml inibitore della tripsina di soia, 1 μ g / ml aprotinina e 5 μ g / ml leupeptina), e autorizzata dalla microcentrifugation. Quantità di proteine ​​equivalenti di ogni campione sono stati separati su SDS-PAGE gel e cancellati per trasferimento di membrana PVDF. Dopo aver bloccato con il 5% di latte scremato secca, immunoblot analisi è stata eseguita seguita da una maggiore rilevazione luminescenza chemio.

Saggio di vitalità cellulare

Cellule in fase logaritmica sono state coltivate ad una densità di 5000 cellule per cm 2 in un 12-pozzetti.Le cellule sono state esposte a varie concentrazioni di Δ 9 -THC e JWH-015 per i tempi indicati. Il 3 – [4,5-dimethylthiazolyl-2] 2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT) vitalità cellulare è stato usato per valutare gli effetti dei cannabinoidi sulla crescita cellulare e per determinare la IC 50 .

Microscopia confocale

Dopo 48 h in coltura, le cellule sono state fissate in paraformaldeide 4% in PBS e incubate con 0,1% Triton X-100 per permeabilizzazione. Immunomarcatura con l’anticorpo policlonale anti-LC3 è stata eseguita mediante incubazione a temperatura ambiente per 1 h. Etichettatura secondaria è stata eseguita con Alexa Farina 594, coniugato IgG anti-coniglio e Alexa Farina 488 (Invitrogen). Imaging è stato con una Leica TCS SP5 laser microscopio confocale a scansione con il software LAS-AF di imaging, con un obiettivo di olio 63 ×.

transfezioni siRNA

Le cellule sono state seminate a 2 × 10 5 cells/35 mm bene il giorno prima della transfezione. Le cellule sono state poi trasfettati in 1 ml contenenti Optimati 4 μ g Lipofectamine 2000 (Invitrogen), con 100nM siRNA duplex o controlli criptato RNA secondo protocolli del produttore. A 24 ore dopo la trasfezione, il mezzo è stato rimosso e sostituito per DMEM contenente 10% di siero fetale bovino. Le cellule sono state poi trattate con cannabinoidi per 48 he usate per saggi MTT vitalità cellulare.

Per ogni trasfezione, sono stati utilizzati i seguenti sequenze: Atg 5 Sequenza senso, 5′-GUGAGAUAUGGUUUGAAUAdTdT-3 ‘ α 1 subunità AMPK prima sequenza senso, 5′-CCCAUAUUAUUUGCGUGUAdTdT-3 ‘secondo senso, sequenza di sequenze senso 5′-GAATCCTGTGACAAGCACAdTdT-3′ della Smart Pool Dharmacon, 5’-CCAUACCCUUGAUGAAUUAUU-3 ‘5’-GCCCAGAGGUAGAUAUAUGUU-3′ 5′-GAGGAUCCAUCAUAUAGUUUU-3 ‘e 5′-ACAAUUGGAUUAUGAAUGGUU-3’. TRB3 sequenza senso 5′-GUGCGAAGCCGCCACCGUAdTdT-3 ‘LKB1 sequenza senso, 5′-GUACUUCUGUCAGCUGAUUdTdT-3’ CaMKK β sequenza senso, 5′-GCUCCUAUGGUGUCGUCAAdTdT-3 ‘(Sigma).

PCR quantitativa in tempo reale

cDNA è stato ottenuto da cellule utilizzando Transcriptor (Roche Applied Science, Mannheim, Germania). Analisi quantitative in tempo reale (qPCR) sono state eseguite utilizzando il FastStart Universale Sonda master mix con Rox (Roche Applied Science), e le sonde sono stati ottenuti dal ProbeLibrary Set universale (Roche Applied Science); ATG 5 senso primer 5′-GACGCTGGTAACTGACAAAGTGA- 3 ‘ATG 5 innesco antisenso, 5′-TAGGAGATCTCCAAGGGTATGCA-3′ TRB3 senso primer 5’-GCCACTGCCTCCCGTTCTTG-3 ‘TRB3 antisenso primer 5′-GCTGCCTTGCCCGAGTATGA-3′ LKB1 senso primer 5’-GGCATGCAGGAAATGCTGGACAGC-3 ‘LKB1 antisenso innesco , 5’-GTGTCCAGGCCGTTGGCAATCTCG-3 ‘CaMKK β innesco senso, 5′-TCGAGTACTTGCACTGCCAGAAGATC-3 ‘CaMKK β antisenso primer 5′-GGGGTTCTTGTCCAGCATACGGGT-3 ’18S senso primer 5′-GCTCTAGAATTACCACAGTTATCCAA-3′ antisenso 18S primer 5′- AAATCAGTTATGGTTCCTTTGGTC-3 ‘. Amplificazioni sono state eseguite in un HT-Fast Real-Time PCR System 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ogni valore è stato regolato utilizzando 18S RNA come riferimento.

Cura e la gestione degli animali

Atimico nude (nu / nu) 5 settimane di età topi maschi sono stati ottenuti da Harlan Iberica Laboratory (Barcellona, ​​Spagna) e mantenuto sotto specifiche condizioni esenti da organismi patogeni con l’approvazione della Animal Care and Utilizzare Comitato di Alcala University. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con la normativa istituzionale spagnolo per la custodia, la cura e l’uso di animali da laboratorio e il rispetto delle direttive comunitarie che regolano la ricerca sugli animali. Raccomandazioni formulate dal Comitato Regno Unito coordinamento su Cancer Research (UKCCCR) sono stati tenuti con cura.

In vivo studi

Per studiare l’ in vivo attività antitumorale dei cannabinoidi, tumori epatocarcinoma sono stati indotti in topi atimici subcutaneal mediante iniezione o per impiantazione fegato. I topi sono stati iniettati per via sottocutanea nel fianco destro con 10 × 10 6 HepG2 o HuH-7 cellule in 0,1 ml di PBS +0,5% BSA. A 2 settimane dal trapianto, i tumori erano cresciuti a un volume medio di 150 mm 3 . I topi sono stati poi divisi in diversi gruppi sperimentali di otto animali ciascuno, che hanno ricevuto i seguenti trattamenti come iniezioni sottocutanee secondo l’esperimento: soluzione salina (controllo); 15 mg / kg di peso corporeo Δ 9 -THC, 1.5 mg / kg di peso corporeo JWH-015; e 1 mg / kg di peso corporeo 3-MA.L’iniezione è stata ripetuta stato continuato ogni giorno e il trattamento per 15 giorni. Volumi del tumore sono stati monitorati ogni giorno utilizzando le misurazioni della pinza e sono stati calcolati con la formula: (4 π / 3) × ( w / 2) 2 × (l / 2). Il peso corporeo degli animali è stata registrata ogni giorno.Per in vivo Atg5 knockdown, tumori xenotrapianto sono state indotte come indicato e 1 nmol specifico Atg5 atelocollagen-complessato siRNA o siRNA di controllo è stato iniettato peritumorally nei giorni 1 e 7 del trattamento. I topi sono stati trattati tutti i giorni per 15 giorni con soluzione fisiologica, 15 mg / kg di peso corporeo Δ 9 -THC o 1,5 mg / kg di peso corporeo JWH-015.

Quando le cellule tumorali sono state impiantate nel fegato, i trattamenti sono stati avviati 1 settimana dopo l’iniezione di cellule e somministrata per via intraperitoneale. Otto stati utilizzati animali in ciascun gruppo sperimentale. Lo studio è stato eseguito per 10 giorni per minimizzare il trauma degli animali ospiti secondo le raccomandazioni UKCCCR. Alla fine del trattamento, gli animali sono stati uccisi e xenotrapiantati tumori e fegati ponderati e congelati.

L’analisi statistica

Dati di vitalità di cellule sono stati espressi come media ± SD e valutate da Student t -test. Differenze sono state considerate significative quando il P -valore era inferiore a 0,05.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministerio de Ciencia e Innovación (Grant SAF2008-03220 per ID, PS09/01401 di GV e SAF2006/00918 a MG), Comunidad de Madrid (Grants CAM / UAH CCG08-UAH/BIO-3914 e CAM S- SAL-0261-2006), Comunidad Castilla-LaMancha (Grant PII1/09-0165-0822) e Santander-Complutense (Grant PR34/07-15856 a GV). NO-H e DV hanno ricevuto borse di studio presso l’Università di Alcalá. MS è stato destinatario di una borsa di studio MEC e di un contratto di formazione da Comunidad de Madrid. Ringraziamo Sonia Hernández, Mar Lorente e Sofia Torres per i loro consigli tecnici così come gli altri membri del nostro laboratorio per il loro continuo supporto.

Glossario

ACC

acetil-CoA carbossilasi

AFP

alfa-fetoproteina

Akt

serina-treonina chinasi Akt

AMPK

adenosina monofosfato chinasi attivata dal

CaMKK

calmodulina chinasi attivata chinasi

CB1

recettore dei cannabinoidi 1

CB2

recettore dei cannabinoidi 2

HCC

carcinoma epatocellulare

HepG2

fegato linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano

HuH-7

cellule di carcinoma epatocellulare

LC3

associata ai microtubuli proteina 1 catena leggera 3 α

LKB1

chinasi epatica B1

3-MA

3-metiladenina

mTOR

bersaglio della rapamicina nei mammiferi

SR1

SR141716A

SR2

SR144528

Δ 9 -THC

Δ 9 -tetraidrocannabinolo

TRB3

triboli omologo 3

TSC2

sclerosi tuberosa 2

Note

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

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Articoli da Cell Death Differentiation e sono forniti qui per gentile concessione di Nature Publishing Group
Stefano Auditore
Presidente Associazione No Profit FreeWeed Board

Nato a Cernusco sul Naviglio, il 12/02/1986

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